Анализ фрагментации ДНК сперматозоидов, методы

Содержание

1. Содержание
2. Показания к анализу
3. Что такое физиологическая фрагментация ДНК сперматозоидов в сперматогенезе
4. Как проводится анализ
5. Патологическая фрагментация ДНК сперматозоидов – что это такое
6. Подготовка к TUNEL-тесту
7. На что влияет повреждение хроматина в мужских половых клетках
8. Анализ (тест) на фрагментацию ДНК сперматозоидов: оценка результатов и расшифровка Tunel-тест
9. Диагностика и лечение
10. Ответы на популярные вопросы
11. Фрагментация ДНК сперматозоидов и привычное невынашивание беременности
12. Что такое физиологическая фрагментация ДНК сперматозоидов в сперматогенезе
13. Нормализация образа жизни
14. Анализ (тест) на фрагментацию ДНК сперматозоидов: оценка результатов и расшифровка Tunel-тест
15. Как подготовиться к исследованию

Содержание

• Сперматогенез
• Что такое фрагментация ДНК сперматозоидов
• Причины
  • Предрасполагающие факторы
• На что влияет повреждение хроматина
• Тест на фрагментацию ДНК сперматозоидов
• Высокий индекс фрагментации и привычное невынашивание
• Как снизить фрагментацию ДНК спермы
  • Хирургическое лечение варикоцеле
  • Пероральные антиоксиданты
• Кому сдавать анализ «Спермограмма с фрагментацией ДНК в сперматозоидах»
• Суть исследования
• Подготовка к сдаче анализа

Показания к анализу

Чтобы выявить разрыв ДНК-цепочки сперматозоидов, проводится специальный тест. Спермограмма в данном случае неинформативна. Она показывает только концентрацию сперматозоидов в эякуляте, их активность. Тест на фрагментацию показан:

• при мужском бесплодии, если отсутствуют другие провоцирующие его факторы;
• если попытки искусственного оплодотворения не дали результата;
• повторяющиеся выкидыши;
• если эмбрион плохого качества;
• мужчинам в возрасте от 45 лет;
• после криохранения образца спермы перед ЭКО (экстракорпоральным оплодотворением);
• при варикозе сосудов семенного канатика;
• если в течение трех месяцев имела место повышенная температура тела.

Также процедуру должны пройти мужчины, работающие в условиях повышенной вредности.

Что такое физиологическая фрагментация ДНК сперматозоидов в сперматогенезе

В организме человека сперматозоид – самая маленькая клетка. Для уменьшения его размера в процессе сперматогенеза (созревания спермия и превращения в зрелый сперматозоид) происходит специфическое преобразование. Ядро уплотняется за счет механизма конденсации хроматина. Большая часть цитоплазмы «выбрасывается» из мужской половой клетки в виде «цитоплазматической капли», остаются только необходимые органеллы.

Схематичное изображение упаковки ДНК в хромосому

Для сборки и упаковки нитей ДНК в хромосомы необходимы белки гистоны. Из ядра будущего сперматозоида удаляются гистоны, а ДНК связывается с белками-протаминами. Это позволяет плотно конденсировать хроматин и уменьшить ядро сперматозоида. В это время происходит «расплетание» участков ДНК и на стадии созревания они должны снова соединиться, но это происходит не всегда.

Как проводится анализ

Для проверки целостности ДНК спермы проводится tunel-тест, предполагающий микроскопическое исследование сперматозоидов. Образец спермы пациент должен собрать в специальный стерильный контейнер с крышкой. Важно! Презерватив не подходит для этой цели, так как компоненты, входящие в его состав, могут оказать негативное влияние на подвижность сперматозоидов.

Чтобы получить точный результат, анализ должен быть проведен в течение часа с момента забора образца. Для этого лаборант добавляет в эякулят реактив. Он, вступая в реакцию с семенной жидкостью, заполняет разрывы ДНК флуоресцирующим нуклеотидом, делая видимыми фрагментированные сперматозоиды. Лаборант проводит их подсчет, который указывается в процентах.

Для получения полной картины параллельно проводится электронно-микроскопическое исследование и спермограмма.

Патологическая фрагментация ДНК сперматозоидов – что это такое

Фрагментация ДНК сперматозоидов – это нарушение целостности ДНК мужской половой клетки, связанное с упаковкой патологического хроматина или дефицита протамина, негативно влияет на репродуктивные исходы при естественном зачатии и в программах ВРТ (ЭКО и искусственная инсеминация – ВМИ).

У бесплодных мужчин индекс сперматозоидов с нарушением целостности хромосом более 30%. При фрагментации ДНК спермы больше 30% вероятность наступления беременности крайне низкая, а ранние потери беременности высокие (замирание, самопроизвольные аборты, внематочная беременность и т. д.).

Подготовка к TUNEL-тесту

Чтобы тест был максимально точным, перед сдачей образца необходимо в течение 2-7 дней: воздержаться от половых контактов, приема лекарственных препаратов, посещения бань. Важно соблюдать режим питания, избегать употребления алкоголя, не курить. Перед забором спермы нужно освободить мочевик.

При повторных проведениях анализа рекомендуется соблюдать последовательность и длительность подготовительных мероприятий, так как это может повлиять на результат.

На что влияет повреждение хроматина в мужских половых клетках

Повышенный процент фрагментации ДНК сперматозоидов:

• снижает фертильный репродуктивный потенциал мужчины;
• снижает частоту наступления беременностей;
• увеличивает репродуктивные потери при ЭКО и естественном оплодотворении, особенно на ранних сроках;
• снижает эффективность программ ВРТ (неудачное ЭКО и ВМИ).

Кроме того, измененная ДНК приводит к хромосомным нарушениям у детей, уменьшает срок жизни потомства, способствует развитию врожденных генетических дефектов у детей.

Анализ (тест) на фрагментацию ДНК сперматозоидов: оценка результатов и расшифровка Tunel-тест

После анализа выдается результат с индексом теста и снимок, на котором зафиксированы фрагментированные сперматозоиды. Индекс – это соотношение между поврежденным и здоровым, способным к оплодотворению, генетическим материалом. В норме показатель не должен быть выше 15%. Это говорит о том, что спермиев с разрушенной цепочкой ДНК меньше, чем здоровых, поэтому репродуктивное здоровье мужчины в порядке и существует высокая вероятность естественного зачатия.

При индексе выше 15%, но ниже 30% сохраняется возможность оплодотворения яйцеклетки естественным способом, но для этого может потребоваться много времени.

Если количество поврежденных сперматозоидов в эякуляте составляет 30-50%, специалисты считают, что наступление беременности естественным путем маловероятно, поэтому рекомендуют ЭКО (экстракорпоральное оплодотворение), внутриматочную инсеминацию (репродуктивная методика, предполагающая введение здоровых, полученных и отобранных заранее сперматозоидов в цервикальный канал) или ИКСИ.

Так, при показателе индекса более 30%, врачи-репродуктологи рекомендуют проводить ЭКО. Если фрагментированный генетический материал составляет 50% и выше, экстракорпоральное оплодотворение малоэффективно. Целесообразно применять интрацитоплазматическую инъекцию сперматозоидов (ИКСИ). При индексе 60% и больше, шансы на успешное оплодотворение минимальны. Проводится ИКСИ, либо берется донорская сперма.

Наиболее прогностически значимым признано исследование фрагментации ДНК в сперматозоидах методом Tunel, но экономически более выгоден Halosperm. Наиболее часто тест проводится методами Tunel, Halosperm.

Расшифровка фрагментации ДНК в спермограмме представлена в таблице 1.

Уровень фрагментации Расшифровка и рекомендации 0-15% Норма. Естественная беременность представляется возможной 15-25% Естественная беременность возможна, но ее ожидание может затянуться. Если беременность не наступает, рекомендуют проведение внутриматочной инсеминации. Если параллельно у женщины есть патологии репродуктивной сферы – следует делать ЭКО. > 30% Наступление беременности маловероятно, шансы увеличатся, если прибегнуть к экстракорпоральному оплодотворению. >50% Беременность при применении ЭКО маловероятна. Рекомендовано ЭКО ИКСИ. >60% Шансы очень малы, единственный выход – ИКСИ или ЭКО донорской спермой.

Анализ на фрагментацию ДНК спермы не входит в стандарты обследования, как спермограмма или МАР-тест.

Tunel-тест может быть рекомендован при:

• идиопатическом бесплодии (когда причина неизвестна);
• после множественных неудачных попыток ЭКО;
• получении в протоколе ЭКО эмбрионов невысокого качества;
• привычном невынашивании и неоднократных выкидышах;
• варикоцеле;
• мужчинам после 45 лет;
• после размораживания криоконсервированной спермы (для крио ЭКО: необходимо убедиться, что процент клеток с поврежденной ДНК не превышает нормы);
• высокой температуре, наблюдаемой в последние 3 месяца.

Патофизиологические процессы, приводящие к повреждению ДНК, не до конца изучены. Определенная схема лечения бесплодия, вызванная этим фактором, пока не разработана. А методы репродуктивной медицины не всегда позволяют достичь положительного результата. Но нормализация структуры ДНК сперматозоидов позволяет улучшить качество эмбрионов и увеличить частоту клинических беременностей.

Диагностика и лечение

Еще недавно отсутствовала возможность выявить поврежденные сперматозоиды, не говоря о том, чтобы это лечить. Сегодня эта проблема поддается лечению. Внедрение инновационных медицинских методик позволяет успешно восстанавливать фрагментированную ДНК сперматозоидов.

Для этого следует устранить или ограничить воздействие факторов, провоцирующих мужское бесплодие: лишний вес, вредные привычки (курение, алкоголь), воздействие токсических, химических веществ (работа на вредных производствах). Второй этап – комплексная диагностика, устранение различных воспалительных процессов в организме, в том числе заболеваний репродуктивной системы мужчины.

Длительность лечения может составлять 3-6 месяцев. Иногда может понадобиться больше. Если терапия оказалась малоэффективной, и количество здоровых сперматозоидов не превышает 20-30%, врачи предлагают паре услугу ИКСИ. Так, из эякулята репродуктологи искусственным путем отбирают здоровый, способный к оплодотворению, генетический материал. Затем его подсаживают в яйцеклетку женщины.

В случае большого количества спермиев с фрагментированным ДНК, также проводиться операция по извлечению их непосредственно из яичек. Это обусловлено тем фактом, что во время эякуляции повышается процент поврежденных клеток.

Ответы на популярные вопросы

Влияет ли прием лекарств на анализ на фрагментацию ДНК?
На фрагментацию ДНК влияет прием некоторых лекарственных средств и химиопрепаратов.

Как улучшить фрагментацию ДНК?
Сначала необходимо разобраться в возможных причинах фрагментации и затем убрать ее причину, если это возможно.

Стандартный анализ спермограммы о фрагментации ДНК ничего не скажет, нужно и отдельное исследование. Показания к нему – самопроизвольные прерывания беременности на ранних стадиях у партнерши и идиопатическое бесплодие мужчины, когда без видимых причин мужчине не удается стать отцом.

Как уже упоминалось, фрагментированные ДНК есть в сперме всех мужчин, разница в количестве. Когда доля сперматозоидов с нарушениями ДНК составляет около 15%, это считается нормой и на фертильность не влияет. А вот 20–30 % – уже говорят о бесплодии. Чем выше процент, тем меньше шансов на зачатие.

Современный способ снижения количества фрагментированных ДНК – коррекция окислительного стресса. Для этого назначают витамины-антиоксиданты и другие вещества с антиоксидантной активностью. Один из таких препаратов – «Синергин». Его эффективность доказана клиническим исследованием в 2016 году.

Фрагментация ДНК сперматозоидов и привычное невынашивание беременности

Среди гинекологов-репродуктологов актуален вопрос привычного невынашивания. Одним из факторов прерывания беременности на сроке до 12 недель в 50% случаев выявляется мужской фактор. Чаще всего это пациенты с фрагментированной ДНК. Поэтому мужчинам рекомендуют делать спермограмму с тестом фрагментации ДНК.

Что такое физиологическая фрагментация ДНК сперматозоидов в сперматогенезе

Стратегия повышения мужской фертильности включает:

1. устранение варикоцеле;
2. здоровый образ жизни;
3. антиоксидантную терапию;
4. применение новейших достижений ВРТ;
5. лечение, направленное на снижение количества внеклеточной ДНК.

Если варикоцеле единственная причина бесплодия, то варикоцелеэктомия (удаление варикозно расширенных вен яичка) приводит к улучшению показателей спермограммы: увеличивается концентрация сперматозоидов и подвижность. Уменьшается фрагментация ДНК спермы, оксидативный стресс, улучшается морфология половых клеток.

Повышается частота наступления спонтанной беременности и уменьшается количество случаев невынашивания в 1 триместре. У прооперированных мужчин с нормозооспермией (нормальными показателями спермограммы) и проведенной варикоцелеэктомией достоверно снижена частота повторного невынашивания беременности.

Нормализация образа жизни

Ожирение, алкоголь, курение, перегревание, радиация (Wi-Fi, мобильные телефоны, пестициды) – способствующие факторы. Необходимо лечение или сведение к минимуму их влияния. Что касается курения, перегревания, алкоголя – их нужно полностью исключить, чтобы уменьшить повреждение ДНК. Важно избавиться от избыточного веса (если он есть).

Препараты, которые используются для лечения сопутствующих заболеваний, также провоцируют повышение фрагментации. Среди них: циметидин, блокаторы Ca каналов, спиронолактон, статины, антибиотики, сульфаниламиды, альфа-блокаторы и другие. Поэтому пару, вступающую в протокол ЭКО, тщательно расспрашивают о применяемых препаратах и по возможности переводят на альтернативные лекарственные средства.

Для лечения повышенной фрагментации ДНК сперматозоидов используются препараты супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы, витамины E, C, каратиноиды, убихинон, селен, цинк, L-карнитин, фолиева кислота, N-ацетилцистеин, коэнзим Q 10.

Употребление в пищу антиоксидантов повышает шансы не только на спонтанное зачатие, но и положительные исходы протоколов ВРТ.

Но единственным научно обоснованным препаратом, понижающим фрагментацию ДНК сперматозоидов, является докозагексаеновая кислота (ДКГ). Это незаменимая полиненасыщенная жирная кислота класса Омега-3, является одним из важных компонентов яичек, спермы, серого вещества мозга, сетчатки, клеточных мембран.

Эмпирическая антиоксидантная терапия подбирается индивидуально и назначается длительным курсом – 12 недель.

Анализ (тест) на фрагментацию ДНК сперматозоидов: оценка результатов и расшифровка Tunel-тест

Для проведения теста сперму сдают как обычную спермограмму. Из образца биоматериала часть используется для светооптического исследования, где оцениваются морфологические качества сперматозоидов и состав спермы. Часть исследуется по методу Tunel.

В пробу для оценки фрагментации добавляют раствор меченных флюоресцирующих нуклеотидов, которые способны связываться с обрывками нитей ДНК. Нуклеотиды встраиваются в разорванную цепочку и выступают в качестве меток, которые флуоресцируют под микроскопом. Затем высчитывается процентное содержание «меченых» сперматозоидов и выдается результат.

Как подготовиться к исследованию

В исследовании эффективности «Синергина» участвовали 27 супружеских пар. У всех мужчин были нормальные показатели спермограммы. У женщин – отсутствие беременности, неоднократные выкидыши или несколько неудачных попыток применения вспомогательных репродуктивных технологий.

Во время исследования мужчины принимали комплекс «Синергин». Он содержит шесть мощных природных антиоксидантов в высокой дозировке: коэнзим Q10, витамин Е, витамин С, рутин, ликопин и бета-каротин. Курс приема составил 3 месяца, это связано с тем, что сперматозоиды созревают 72 дня. Любой курс, направленный на улучшение состояния мужской фертильности, обычно имеет такую продолжительность.

Перед сбором биоматериала действуют те же требования, как и перед сдачей спермограммы:

• Половое воздержание не менее 2 и не более 7 дней. Лучшее время – 3 суток. Если сдается анализ повторно, то лучше чтобы промежутки воздержания были одинаковыми.
• Отказ от алкоголя, курения, перегревания (сауны, бани и т.д.) сроком 3 месяца (весь процесс сперматогенеза длится в среднем 72 дня).
• Прекращение приема любых лекарственных препаратов, если врачом не указано обратное и нет угрозы жизни из-за прерывания терапии.
• Если мужчина перенес ОРВИ, грипп и другие заболевания с повышением температуры тела – сдачу анализа необходимо перенести.
• Накануне исключить физические и эмоциональные нагрузки.

Весь период подготовки необходимо правильное питание и соблюдение питьевого режима (1,5-2 литра в день).

Необходимо понимать, что качественные характеристики мужских половых клеток меняются во времени, в отличие от женских. Поэтому, точность результатов зависит от того, насколько вы серьезно подойдете к вопросу подготовки и лечению (для повторного теста на фрагментацию).

1. Сколько дней живут сперматозоиды в женском организме
2. Как вырабатывается сперма: где образуется, как и сколько длится созревание, через сколько происходит обновление сперматозоидов
3. Сперма в моче – убивает ли моча сперматозоиды. Семяизвержение в мочевой пузырь — ретроградное семяиспускание